目的通过正交试验及镇痛抗炎实验探讨复方南星止痛膏处方最佳提取工艺。方法采用正交试验法优选白芷、川芎等药材醇提工艺;采用鼠尾压痛及小鼠足趾肿胀 药效学实验对丁香等药材中挥发油不同提取方法的提取物进行镇痛及抗炎作用对比,优选丁香等药材中挥发油的提取工艺。结果复方南星止痛膏处方白芷、川芎等 药材最佳醇提工艺为加入8倍量70%乙醇,提取2次,每次1.5 h;丁香等药材95%醇提液对小鼠痛阈值的增大作用及小鼠足趾肿胀的抑制作用大于水蒸气蒸馏所得的挥发油及水煎液。结论该法简便、可靠,可为复方南星止 痛膏现代制剂的开发提供技术参考。
关键词 复方南星止痛方;正交试验;欧前胡素;阿魏酸;鼠尾压痛实验;小鼠足趾肿胀实验;提取工艺
收稿日期 2012-10-30
基金项目 中药制药过程新技术国家重点实验室开放基金项目(SKL2010M0302);北京中医药大学复方中药制药研究创新团队项目(2011-CXTD-13);北京中医药大学自主选题项目(2011JYB22XS-063)
通信作者 *杜守颖,教授,博士生导师,主从事中药新剂型与新技术研究,Tel(010)84738615,E-maildushouying@263.net
作者简介 黎迎,硕士研究生,E-maillysole@126.com 复方南星止痛膏是一种传统的外用橡胶膏剂,由丁香、肉桂、白芷、川芎等中药组成,具有散寒除湿,活血止痛的作用。临床上用于寒湿瘀阻所致的关节疼痛,肿 胀,活动不利,遇寒加重,舌质暗淡或瘀斑1。原工艺将处方中各味药以粉末形式制成橡胶膏剂,载样量小,成型性差,容易出现裂膏现象,皮肤顺应性差。有文献报道方中白芷药材所含的欧前胡素2,川芎药材所含的阿魏酸3,丁香4、乳香5、没药5等 药材所含的挥发油均有明显的镇痛抗炎作用。因此在复方南星止痛膏处方提取研究中,本文选择以欧前胡素及阿魏酸含量之和评分的方案,优化白芷、川芎等药材醇 提工艺;对丁香等药材的95%乙醇提取液,水蒸气蒸馏所得挥发油及水煎液进行小鼠镇痛及抗炎作用对比,优选丁香等药材挥发油的最佳提取工艺。
1 材料
LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司,SPD-20A,VWD检测器,LC Solution色谱工作站);YLS-3E电子压痛仪(山东省医学科学院设备站);BSA224S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);RE- 52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
阿魏酸、欧前胡素对照品均购于中国食品药品检定研究院,批号分别为110773-201012, 110826-201013);双氯芬酸钠肠溶片(国药准字H11021640,北京诺华制药有限公司);20%鸡蛋清(实验前自制)。甲醇(色谱 纯,Promptar公司);冰醋酸(色谱纯,美国FISHER公司);纯净水(娃哈哈公司);其他试剂均为分析纯。白芷、川芎、丁香等10味药均由安国 市以岭中药材饮片有限公司提供,冰片由贵州金色制药有限责任公司提供,樟脑由江苏康缘药业股份有限公司提供,经北京中医药大学刘春生教授鉴定,符合 2010年版《中国药典》的求。
KM小鼠,18~22 g,雄性,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物批准号0251943,实验前适应性饲养一周。
2 方法与结果
2.1 工艺设计
对方中白芷、川芎等药材进行乙醇回流提取,丁香等药材提取其挥发油。通过正交试验及药效学实验对白芷、川芎等药材醇提工艺及丁香等药材挥发油的提取工艺进行考察。
2.2 欧前胡素、阿魏酸含量测定方法的建立
2.2.1 色谱条件 Merck C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以甲醇(A)-1%醋酸溶液(B)为流动相,进行梯度洗脱,0~21 min,30%A,21~22 min,30%~62%A,22~60 min,62%A,流速1 mL·min-1;检测波长300,321 nm;柱温30 ℃。对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1。
1. 阿魏酸;2. 欧前胡素;a. 300 nm;b. 321nm;A. 对照品;B. 供试品。
图1 白芷、川芎等药材提取物的HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of medicinal extracts
2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取欧前胡素对照品2.82 mg,阿魏酸对照品2.65 mg于25 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得每1 mL含欧前胡素113 μg,阿魏酸106 μg的对照品溶液。此为对照品原液,备用。精密吸取上述对照品原液1 mL于5 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即得每1 mL含欧前胡素22.6 μg,阿魏酸21.2 μg的对照品溶液。
2.2.3 线性关系的考察 精密吸取2.2.2项下对照品溶液0.5,4,6,10,16,20,30 μL注入高效液相色谱仪,记录峰面积。以峰面积为横坐标,进样量(μg)为纵坐标进行曲线回归,阿魏酸、欧前胡素在0.010 6~0.636 0,0.011 3~0.677 0 μg线性关系良好,线性方程分别为 Y =125 304 X +12 762( r =0.999 9), Y =62 065 X +7 844.7( r =0.999 9)。
2.2.4 精密度试验 精密吸取2.2.2项下对照品溶液10 μL,重复进样6次,阿魏酸,欧前胡素峰面积的RSD分别为1.5%,0.89%,表明在此条件下仪器精密度良好。
  2.2.5 稳定性试验 取阿魏酸和欧前胡素对照品溶液按2.2.1项下条件分别于0,2,4,6,8,12,16,20,24 h进样,阿魏酸和欧前胡素峰面积的RSD分别为1.4%,1.2%,表明对照品溶液在常温下24 h稳定。
2.3 正交试验优化白芷、川芎等药材提取工艺
选择乙醇浓度、溶剂倍数、提取时间、提取次数4个因素,每个因素设计3个水平,按照正交试验L9(34)表进行试验,分别以欧前胡素、阿魏酸含量为指标进行工艺考察。因素水平见表1。
表1 白芷、川芎等药材提取工艺正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of extraction process
按处方比例称取白芷、川芎等药材,按照正交试验设计因素水平表进行试验,结果见表2,3。
表2 白芷、川芎等药材提取工艺正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experimentmg·g-1
表3 白芷、川芎等药材提取工艺正交试验方差分析
Table 3 Results of analysis of variance
注 f =2, F0.01(2,2)=9.00。
经统计学软件分析,最佳工艺为 A1 B3 C2 D2,而正交试验中欧前胡素和阿魏酸含量之和最高的试验是 A1 B3 C2 D2,因此将 A1 B3 C2 D2和 A1 B3 C2 D2进行验证,以确定提取工艺。
2.4 验证试验 验证试验表明 A1 B3 C2 D2和 A1 B3 C2 D2无显著性差异,考虑到A1 B3 C2 D2缩短了提取时间,提高了生产效率,因此醇提组最终工艺定为 A1 B3 C2 D2,即加8倍量70%乙醇,每次提取1.5 h,共提取2次。
2.5 丁香等药材挥发油提取工艺优选
本部分对丁香等药材中挥发油不同提取方法的提取物进行小鼠镇痛及抗炎作用对比,优选丁香等药材的最佳提取工艺。
2.5.1 药物的配制 按处方比例称取丁香等药材共3份。一份采用95%乙醇回流提取、浓缩后得提取液;一份采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,收集得到挥发油,水煎液经过醇沉、浓缩 后得到水提醇沉液;另一份采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,收集得到挥发油;将以上提取液或挥发油分别按处方比例,与70%醇提浓缩液、冰片、樟脑混合,均配 成1 mL含1 g生药的样品溶液,依次为95%醇提组、挥发油+水煎液组、挥发油组,实验时用蒸馏水稀释成每1 mL 含0.25 g生药的供试液。
2.5.2 给药方法 将动物随机分为5组,分别为空白组(A)、阳性组(B)、95%醇提组(C)、挥发油+水煎液组(D)、挥发油组(E),每组10只小鼠,95%醇提组、 挥发油组、挥发油+水煎液组的药液及空白组的生理盐水用纱布浸渍,放于烧杯底部,让小鼠四肢充分接触药液。阳性组按19.5 μg·g-1灌胃双氯芬酸钠肠溶片(以生理盐水配制成相应质量浓度)。
2.5.3 鼠尾压痛实验6 施压时以小鼠出现挣扎或嘶叫作为疼痛反应指标,此压力值即为该鼠痛阈值(g)。用药前,用电子压痛仪测其痛阈值2次,以连续2次的平均值作为给药前的基础 痛阈值。各组于用药后0.5,1,2,4,6 h 按上述基础痛阈值测定法分别测定痛阈值2次,取平均值。给药后痛阈提高率=(给药后痛阈值-给药前痛阈值)/给药前痛阈值×100%,结果见表4。
表4 不同提取物对鼠尾压痛法所致小鼠疼痛的影响( ±s,n= 10)
Table 4 The effect of different extractive on mice pain caused by ail pain tenderness test ( ±s,n= 10)%
注A. 模型组;B. 阳性组;C. 95%醇提组;D. 挥发油组;E. 挥发油+水煎液组。与空白组比较1) P <0.01(表5同)。 以上分析可知,与空白组比较复方南星止痛膏处方提取物均具有镇痛作用,给药后30 min,挥发油+水煎液组效果较好,但给药30 min以后,95%醇提组效果最好,镇痛作用强,维持时间长,所以选择95%醇提取复方南星止痛膏处方中各药的挥发性成分。 2.5.4 小鼠足趾肿胀实验7各组小鼠右后足趾皮内注射20%鸡蛋清0.05 mL。致炎后立即给药,于致炎后0.5,1,2,4,6 h用坐标纸分别测量肿胀足趾周长,计算肿胀度(mm)及肿胀抑制率(%)。肿胀度=致炎后足趾周长值-致炎前足趾周长值。肿胀抑制率=(对照组平均肿胀度 -给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100%,结果见表5。0.5,1,2,4,6 h 3组提取物消肿效果无显著性差异,考虑到水蒸气蒸馏提取时间长,不利于工业化生产,95%醇提工艺简单,提取时间短,所以选择95%醇提取复方南星止痛膏 处方中各药的挥发性成分。   表5 不同提取物对鸡蛋清致小鼠足肿胀的影响( n= 10) Table 5 The effect of different extractive on mice foot swelling caused by egg white ( n= 10) 由此可见,复方南星止痛方中白芷、川芎等药材采用乙醇提取的最佳工艺为8倍量70%乙醇提取2次,每次1.5 h。丁香等药材提取挥发油的最佳工艺为95%乙醇提取。 3 讨论 本研究采用正交试验筛选出复方南星止痛膏处方中白芷、川芎等药材的最佳回流提取工艺,使欧前胡素和阿魏酸得率均较高,工艺合理、稳定,可为工业生产及复方南星止痛方的下一步研制提供理论依据。 目前中药复方提取工艺研究中,大多数采用单一有效成分或有效部位含量作为指标筛选工艺,但这些化学成分往往难以代表整个复方的药效,若结合药 效学实验进行筛选,使提取工艺更趋科学、合理。复方南星止痛膏处方中挥发油成分复杂,有效成分不明确,本实验以药效学作用作为考察指标,研究结果将为优化 确定其提取工艺提供依据。 本研究采用正交试验结合鼠尾压痛法、小鼠足趾肿胀法来评价复方南星止痛膏处方中各味药提取物的镇痛和抗炎作用,此方法能基本反映提取物的疗效,用于评价和筛选制备工艺是可行的。 参考文献 1 新药转正标准31.复方南星止痛膏S. 2 Marqyez N, Sancho R, Ballero M, et al. Imperatorin inhibits T-cell proliferation by targeting the transcription factor NFATJ. Planta Med, 2004, 70(11)1016. 3 梁娜, 孙少平, 罗跃娥, 等. 阿魏酸的研究进展J. 黑龙江中医药, 2009, 339. 4 李巧如, 任健康, 赵院利, 等. 丁香提取物抗金葡球菌的活性成分的筛选J. 中药新药与临床药理, 2003, 14(2)108. 5 郑杭生, 冯年平, 陈佳, 等. 乳香没药的提取工艺及其提取物的镇痛作用J. 中成药, 2004, 26(11)956. 6 战祥毅, 王文萍, 王艳, 等. 中药止痛巴布贴镇痛效果实验J. 辽宁中医药大学学报, 2011, 13(7)45. 7 黄真,冯春荣. 孝扇草水提液抗炎镇痛作用的实验研究J. 中华中医药学刊, 2010, 28(6)1142. Optimization of extraction process of prescription of compound Nanxing pain-relieving cataplasm by combining orthogonal design and pharmacodynamic experiment LI Ying, DU Shou-ying*, LU Yang, BAI Jie, XU Pan, WANG Ying-zi, WANG Yue (Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China) Abstract Objective To discuss the optimum extraction process of compound Nanxing pain-relieving cataplasm through orthogonal design and pharmacodynamic experiment. Method The orthogonal experiment method was adopted to optimize the ethanol extraction process with Angelica dahurica, Ligusticum chuanxiong and other herbs. The anti-inflammatory and analgesic effects of extracts from volatile oil in such herbs as syzygium aromaticum with different extraction processes were compared by tail pain tenderness test and food-pad swelling in mice, in order to optimize the extraction process of extracts from volatile oil in such herbs as syzygium aromaticum. Result The optimum extraction process of A. dahurica , L.chuanxiong and other herbs for compound Nanxing pain-relieving cataplasm were as follows adding 8-fold amount of 70% alcohol, extracting for 2 times with 1.5 h each time. The 95% ethnol extracts of syzygium aromaticum and other herbs had more effect in the increasing the threshold of pain and the inhibition of toe swelling of mice than volatile oil obtained from steam distillation as well as volatile oil and water decoction obtained from steam distillation. Conclusion The method is simple and reliable that it can provide technical reference for the development of modern preparations of compound Nanxing pain-relieving cataplasm. Key words compound Nanxing pain-relieving cataplasm; orthogonal design; imperatorin; ferulic acid; tail pain tenderness test; food-pad swelling in mice; extraction process doi10.4268/cjcmm20131609